три

npj Биопленки и микробиомы, том 9, Номер статьи: 57 (2023) Цитировать эту статью

2065 Доступов

18 Альтметрика

Подробности о метриках

Множество стрессовых факторов, которые могут повредить микробные клетки, привели к появлению сложных механизмов реакции на стресс. Хотя существующие биорепортеры могут отслеживать индивидуальные реакции, датчиков для обнаружения мультимодальных стрессовых реакций у живых микроорганизмов все еще не хватает. Ортогонально детектируемые красные, зеленые и синие флуоресцентные белки, объединенные в одну плазмиду, получившую название репортер RGB-S, позволяют проводить одновременный, независимый и в реальном времени анализ транскрипционного ответа Escherichia coli с использованием трех промоторов, которые сообщают о физиологическом стрессе (PosmY для RpoS). ), генотоксичность (PsulA для SOS) и цитотоксичность (PgrpE для RpoH). Биорепортер совместим со стандартным анализом и флуоресцентно-активируемой клеточной сортировкой (FACS) в сочетании с последующим анализом транскриптома. Различные стрессоры, в том числе биотехнологически значимый 2-пропанол, активируют одну, две или все три реакции на стресс, что может существенно повлиять на метаболические пути, не связанные со стрессом. Репортер RGB-S, реализованный в микрофлюидном культивировании с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии, позволил проводить пространственно-временной анализ живых биопленок, выявляя стратифицированные субпопуляции бактерий с гетерогенными реакциями на стресс.

Понимание того, как микроорганизмы опосредуют адаптивные изменения для обеспечения выживания в изменяющихся условиях окружающей среды, требует мониторинга соответствующих путей реакции на стресс. RpoS, SOS и RpoH являются важнейшими путями реакции на стресс, которые модулируют пути транскрипции посредством широкого спектра стрессовых стимулов, что имеет значение для образования и пролиферации биопленок1,2, вирулентности патогенов3, устойчивости к антибиотикам4, эволюции4 и экологической конкуренции5. RpoS представляет собой альтернативный сигма-фактор, который прямо и косвенно регулирует около 500 генов в Escherichia coli (E. coli)6. Активация RpoS, известная как общая реакция на стресс, в основном стимулируется голоданием как индикатором физиологического стресса7. С другой стороны, SOS-ответ включает более 50 генов, которые выполняют несколько функций в ответ на повреждение ДНК, вызванное химическими, физическими или биологическими агентами8. Следовательно, усиление SOS-ответа связано с клеточной генотоксичностью. Альтернативный сигма-фактор RpoH является ключевым регулятором реакции стресса на тепловой шок у E. coli, который включает более 30 генов9,10. Активация ответа RpoH стимулируется накоплением развернутых белков в клетке, что является показателем цитотоксичности.

Учитывая высокую значимость этих биологических процессов для технологий и медицины, всестороннее понимание лежащих в их основе молекулярных механизмов имеет исключительную важность. Например, мониторинг клеточных реакций на многочисленные стрессоры может внести важный вклад в понимание жизнеспособности и продуктивности клеток11, таких как ингибирование продуктов, лишение питательных веществ, pH или напряжение сдвига12, а также для мониторинга различных токсикантов окружающей среды, таких как гербициды или антибиотики13. Поэтому мультимодальный анализ реакции микроорганизмов на стресс будет важен не только для фундаментальных исследований, но и для биотехнологических процессов.

С этой целью было разработано несколько генетически кодируемых бактериальных биосенсоров12,13,14,15,16,17,18. Обычно используемыми репортерными элементами являются колориметрические репортеры β-галактозидазы (lacZ)15 и биолюминесценции (luc, lux)16. Поскольку эти системы обычно требуют лизиса клеток, многоэтапных анализов или каталитических реакций, которые ограничивают онлайн-измерения и многоцветную отчетность, для анализа реакции на стресс были разработаны репортеры на основе флуоресценции17,18. Однако доступные в настоящее время системы не способны сообщать о мультимодальном ответе живых клеток с высоким пространственно-временным разрешением. Здесь мы описываем генетически закодированный трехцветный флуоресцентный биосенсор, который одновременно отображает бактериальную реакцию на физиологический стресс, генотоксичность и цитотоксичность посредством мониторинга соответствующих путей реакции на стресс (рис. 1 и дополнительный рисунок 1).